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07月19 【成功案例】通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析合浦珠母貝同種異體移植血細(xì)胞中免疫相關(guān)差異表達(dá)基因的鑒定
Differentially expressed immune-related genes in hemocytes of the pearl oyster Pinctada fucata against allograft identified by transcriptome analysis
雜志：Fish & Shell?sh Immunology
影響因子：3.148
PMID:?28126621
研究背景：合浦珠母貝是在中國(guó)普遍養(yǎng)殖的海洋珍珠貝，占海洋珍珠產(chǎn)業(yè)90%以上的比例。為了培養(yǎng)珍珠，需要將供體珍珠牡蠣的地幔片用細(xì)胞核移植到受體中，但是移植后的免疫抑制反應(yīng)會(huì)使成功率降低。加強(qiáng)了解宿主牡蠣對(duì)移植體的免疫反應(yīng)有利于提高珍珠培養(yǎng)技術(shù)的效率。然而，當(dāng)前的研究中關(guān)于珍珠貝對(duì)同種異體移植的免疫抑制報(bào)道卻很少。本文擬通過(guò)對(duì)移植的合浦珠母血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，獲得移植反應(yīng)過(guò)程相關(guān)基因。
研究材料：?
生長(zhǎng)1.5年的健康合浦珠母貝（P. fucata）
將和浦珠母貝進(jìn)行同種地幔片移植手術(shù)，分別收集手術(shù)后0h和48h血淋巴，每個(gè)時(shí)期選取6-7只牡蠣的樣本進(jìn)行混合，分別提取兩個(gè)樣本的total RNA。
研究方法：在本研究中，對(duì)同種異體移植后0小時(shí)和48小時(shí)的珍珠貝的血細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。與合浦珠母貝的參考基因組進(jìn)行了比對(duì)，為了鑒定所有與免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因，本研究進(jìn)行了GO注釋和KEGG通路分析。最后，隨機(jī)篩選免疫相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，以確保研究的準(zhǔn)確性。
測(cè)序平臺(tái)：Illumina Hiseq 2500 platform
測(cè)序數(shù)據(jù)量：測(cè)序得到92.5M的clean reads
技術(shù)路線：
解析-通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析合浦珠母貝同種異體移植血細(xì)胞中免疫相關(guān)差異表達(dá)基因的鑒定769.png)
結(jié)果
結(jié)果
1.測(cè)序結(jié)果
兩個(gè)樣本Raw reads經(jīng)過(guò)去接頭和去低質(zhì)量的reads后分別得到6.1Gb（0h）和6.2Gb（48h）的數(shù)據(jù)量。且每個(gè)樣本的Q30值都大于92%，GC含量分別是44.73%（0h）和42.19%（48h），與合浦珠母貝參考基因組比對(duì)率分別是58.95%（0h）和60.27%（48h），如表1所示。
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表1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
2.基因注釋結(jié)果
與合浦珠母貝參考基因組比對(duì)，共獲得1912個(gè)新基因，通過(guò)與NR/Swiss-Prot/ GO/ COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，其中1579個(gè)基因找到注釋信息，另外333個(gè)基因沒(méi)有在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到注釋信息，如表2所示
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表2.新基因注釋信息統(tǒng)計(jì)
3.兩組之間差異表達(dá)分析結(jié)果
比對(duì)0h和48h基因表達(dá)量，共獲得798個(gè)差異表達(dá)基因（其中410個(gè)上調(diào)基因，388個(gè)下調(diào)基因）。在這些差異表達(dá)基因中其中有226個(gè)與編碼熱休克蛋白家族的基因在0h高表達(dá)，其中314個(gè)與編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和EF-hand 鈣離子結(jié)合蛋白的相關(guān)基因在48h高表達(dá)，這些基因都與免疫防護(hù)有關(guān)。
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圖1.0h/48h每個(gè)基因表達(dá)水平火上圖
4.差異表達(dá)基因功能注釋結(jié)果
為了進(jìn)一步研究這些差異表達(dá)基因的生物學(xué)價(jià)值，對(duì)這798個(gè)差異表達(dá)基因按照功能進(jìn)行GO富集分析，共產(chǎn)生45個(gè)GO terms。所有的基因都?xì)w到cellular?component（17個(gè)terms），molecular function（11個(gè)terms）和biological processes（17個(gè)terms）三個(gè)功能類別，其中與免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因主要富集在“biological process”一類，且這一類別中有9個(gè)差異表達(dá)基因富集在免疫系統(tǒng)過(guò)程子分類，有67個(gè)差異表達(dá)基因富集在刺激反應(yīng)子分類。
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圖2.差異表達(dá)基因GO分類
5.免疫反應(yīng)相關(guān)差異表達(dá)基因的鑒定結(jié)果
為了在這些差異表達(dá)基因中更進(jìn)一步的挖掘免疫相關(guān)基因，研究人員將免疫反應(yīng)相關(guān)差異表達(dá)基因按照不同功能進(jìn)行分類，獲得64個(gè)GO terms，其中包含51個(gè)差異表達(dá)基因，有刺激反應(yīng)（8個(gè)基因）、抗菌體液反應(yīng)（5個(gè)基因）、對(duì)壓力的響應(yīng)（8個(gè)基因）。其他的GO terms主要與這些子分類相關(guān)：受體介導(dǎo)的胞吞、真菌反應(yīng)、饑餓反應(yīng)以及損傷修復(fù)。鑒定了一些參與細(xì)胞凋亡和死亡的基因，包含金屬蛋白酶-19基質(zhì)、絲氨酸/蘇氨酸激酶、Kr-h1、酪氨酸蛋白激酶Abl、和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。另外，有24個(gè)差異表達(dá)基因?qū)儆诖碳?、壓力和溫性反?yīng)的GO類別。這些基因跟移植免疫反應(yīng)相關(guān)（其中6個(gè)上調(diào)，18個(gè)下調(diào)），包括TLR 和HSP。
研究人員將以上獲得的所有的差異表達(dá)基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)去尋找與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因。在798個(gè)差異表達(dá)基因中，有122個(gè)基因?qū)?yīng)到64個(gè)KEGG通路。其中，19個(gè)免疫相關(guān)基因?qū)?yīng)到16個(gè)通路，包括內(nèi)吞作用（5個(gè)）、NOD-like受體信號(hào)通路（1個(gè)）、泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)水解（4個(gè)）和其他路徑。研究人員主要關(guān)注抵御病原體入侵相關(guān)的toll-like受體信號(hào)通路和溶酶體。這一路徑有四個(gè)主要的基因家族，分別有TLRs、?IRFs、Ils和?TNFs。共鑒定了1個(gè)與TLR信號(hào)通路相關(guān)的unigene，2個(gè)與溶酶體相關(guān)的unigene 。
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圖3.Unigene的KEGG通路分布圖
該研究通過(guò)基因注釋、聚類分析和通路分析的方法，最終鑒定了72個(gè)典型的免疫基因（其中25個(gè)上調(diào)基因，47個(gè)下調(diào)基因）。隨后，研究人員將這些免疫相關(guān)差異表達(dá)基因按照不同時(shí)期進(jìn)行分層聚類分析，在0h和48h兩個(gè)時(shí)期的免疫相關(guān)差異表達(dá)基因有明顯不同，說(shuō)明移植前后牡蠣中免疫相關(guān)變化明顯。
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圖4.?分層聚類分析
6.qRT-PCR驗(yàn)證
研究者隨機(jī)對(duì)其中18個(gè)免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示用qRT-PCR檢測(cè)到的倍性變化與RNA-Seq的表達(dá)模式相比，結(jié)果基本一致，且RNA-Seq檢測(cè)更敏感。
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圖4.qRT-PCR驗(yàn)證
研究結(jié)論
該轉(zhuǎn)錄組研究共發(fā)現(xiàn)了1912個(gè)新基因，移植和非移植組比對(duì)后共有798個(gè)差異表達(dá)基因，通過(guò)GO富集和KEGG通路分析等方式最終鑒定出了72個(gè)典型的免疫相關(guān)基因，包括TLRs、細(xì)胞因子、HSPs、細(xì)胞凋亡和抗氧化劑等。另外，通過(guò)qRT-PCR對(duì)其中18個(gè)免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RNA-Seq的結(jié)果基本一致表明該實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可信。
創(chuàng)新點(diǎn)
首次通過(guò)合浦珠母貝轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究尋找到與同種異體移植免疫相關(guān)的基因，為進(jìn)一步分析合浦珠母貝同種異體移植的免疫抑制提供了依據(jù)，為同種異體移植牡蠣存活率的提高提供了有價(jià)值的信息。