06月03 小麥Bax抑制劑-1蛋白（BI-1）與水通道蛋白TaPIP1相互作用增強擬南芥抗病性
隨著高通量測序技術的出現，測序數據量呈現指數級增長，各類公共數據規模日益龐大，公共數據整合分析已逐漸成為很多研究中的一項重要分析手段。利用公共數據一方面可以降低研究成本，另一方面可以補充一些受限于研究者研究背景與技術水平而難以自主檢測的關鍵數據。截至目前，高通量測序數據庫SRA數據庫已收錄超過10Pbase的NGS數據，但是由于公共數據整合分析過程中下載、存儲和分析各個環節都存在較高的技術門檻，導致研究者對公共數據的利用不充分。對于這些問題百邁客已經提供了非常成熟的解決方案，一鍵式導入即可完成數據的下載和存儲，輔以平臺上多達25個高度集成化的分析流程，可視化界面助您輕松搞定分析難題。中國農業科學院馬有志老師課題組的徐兆師研究員等研究人員在百邁客云平臺結合公共數據完成擬南芥抗病性研究，成果于2018年1月22日發表在《Frontiers in Plant Science》上，影響因子4.298。
摘要
Bax抑制劑-1（BI-1）是真核生物中進化保守的內質網（ER），定位細胞死亡抑制因子。 BI-1抑制生物和非生物脅迫的能力在擬南芥中得到了充分研究，而小麥中BI-1的功能在很大程度上是未知的。在這項研究中，將禾谷鐮刀菌（Fg）處理的小麥進行RNA-seq分析，然后分離小麥BI-1基因TaBI-1.1。通過水楊酸（SA）處理誘導TaBI-1.1表達，并通過脫落酸（ABA）處理誘導TaBI-1.1的下調。基于β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色，TaBI-1.1在成熟葉和根中表達，但不在下胚軸或幼葉中表達。 TaBI-1.1在擬南芥中的組成型表達增強了其對丁香假單胞菌病毒（Pst）DC3000感染的抗性并誘導SA相關基因表達。此外，TaBI-1.1轉基因擬南芥顯示出由高濃度SA引起的損害的減輕，并降低了對ABA的敏感性。與表型一致，35S :: TaBI-1.1和Col-0植物的RNA-seq分析顯示TaBI-1.1參與生物脅迫。這些結果表明，TaBI-1.1正向調節SA信號并在對生物脅迫的響應中起重要作用。此外，TaBI-1.1與水通道蛋白TaPIP1相互作用，并且它們都定位于ER膜（內質網膜）。此外，研究人員證明了SA處理后TaPIP1上調，并且TaPIP1轉基因擬南芥增強了對Pst DC3000感染的抗性。由此表明，在ER膜上TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能發生在對SA信號和防御反應的響應中。
使用擬南芥Columbia-0（Col-0）作為TaBI-1.1過表達的背景， 突變體atbi1-2從擬南芥生物資源中心（ABRC）獲得。 從栽培的小麥品種小白麥擴增TaBI-1.1和TaPIP1的cDNA， 將PCR產物克隆到pLB載體中，使用DNAMAN 6.0軟件進行氨基酸序列同一性比較。
RNA-Seq Analysis
收集來自4周齡Col-0和轉基因系35S :: TaBI-1.1的葉片用于RNA-seq分析，使用HiSeq 2500平臺測序。測序數據與TAIR 10擬南芥參考基因組比對。使用TopHat和Cufflink軟件包進行mRNAseq數據分析以及DEG的鑒定和分析。通過GOseq軟件進行差異表達基因的GO富集分析。根據KEGG數據庫通路進行KEGG富集分析，尋找差異表達基因的富集通路。在百邁客云平臺（BMKCloud）完成小麥Fg處理的RNA-seq數據下載和分析， SRA數據庫（登錄號：PRJNA289545）。
其他實驗：1.qRT-PCR分析；2.轉基因擬南芥植株在脅迫處理下的應答及性狀評價；3.β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）活性測定；4.細菌接種和細菌生長的監測；5.酵母雙雜交系統；6.Pull-Down assay（免疫沉淀法）；7.亞細胞定位測定；8.ELISA Assay（酶聯免疫吸附試驗）
分析結果
1.通過qRT-PCR和β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色確定TaBI-1.1的表達模式
研究人員分析了來自Fg處理的小麥RNA-seq數據，以研究植物防御信號通路。從RNA-seq分析中分離出前10個差異表達基因。在這10個基因中鑒定了兩個小麥BI-1基因：TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980。 TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_515717_AA1671980在之前的研究中被命名為TaBI-1。在小麥Ensembl數據庫中僅篩選出三種BI-1基因：TaBI-1，TRIAE_CS42_U_TGACv1_644608_AA2140670和TRIAE_CS42_6AS_TGACv1_488014_AA1573990。在兩個差異表達的BI-1基因中， TaBI-1.1的差異最大。根據氨基酸比對，TaBI-1.1與TaBI-1同一性達到99.19％。與對照相比，Fg處理對TaBI-1.1的表達水平上調24倍。許多關于AtBI-1的研究已經證實AtBI-1在植物中對生物和非生物脅迫的抗性中起關鍵作用。 TaBI-1.1蛋白的序列與AtBI-1有69.88％的同一性，表明該序列在BI-1家族中基本保守。使用qRT-PCR監測TaBI-1.1的表達模式以確定TaBI-1.1在生物和非生物脅迫中可能的作用。TaBI-1.1的表達在響應SA處理時顯著上調，在響應ABA處理時下調。 SA處理48小時后TaBI-1.1表達達到8倍高峰（圖1A）。 響應ABA處理的下調水平在8小時達到初始水平的約1/5（圖1C）。 響應NaCl處理，表達水平在4小時后下降，在2小時稍微增加并且在8小時后回到其初始水平（圖1B）。
研究者創建了含有1.7kb TaBI-1.1啟動子并生成轉基因擬南芥的PBI :: GUS融合構建體，以研究TaBI-1.1的空間表達模式。使用GUS染色測定組織GUS活性。在成熟葉和根中有TaBI-1.1表達，但在下胚軸和幼葉中觀察不到（圖1D）。還檢測了各種小麥組織中的TaBI-1.1表達水平，包括根，莖，葉和小穗，結果表明TaBI-1.1的表達在這些小麥組織中普遍存在，而且在葉中最高，在小穗中最低（圖1I）。在SA和NaCl處理之后，成熟葉中的表達與對照相比增加，并且SA處理的表達更高。當SA和NaCl處理時，在下胚軸中也檢測到表達（圖1E，F）。在ABA處理的植物的葉子中檢測到較弱的表達（圖1G）。通過qRT-PCR進一步證實GUS表達水平（圖1H）。以上結果表明，TaBI-1.1在各種脅迫下均有表達。
圖1. 通過qRT-PCR和GUS染色評估TaBI-1.1的相應表達模式
2.TaBI-1.1的表達增強了擬南芥對Pst DC3000感染的抗性
經過Fg和SA處理后表達上調，假設TaBI-1.1可能參與生物脅迫反應。研究人員在擬南芥中異位表達TaBI-1.1，在花椰菜花葉病毒（CaMV）35S啟動子的控制下驗證這一假設。選擇兩個TaBI-1.1表達水平相對較高的純合株系3和7（35S :: TaBI-1.1＃1和35S :: TaBI-1.1＃2）用于進一步分析（圖2A）。將atbi1-2，Col-0和兩個轉基因品系的四周齡葉子進行Pst DC3000感染或10mM MgCl 2處理（模擬物）。在模擬實驗中，在用10mM MgCl 2處理3天后，在atbi1-2，Col-0和兩個轉基因品系的葉中沒有觀察到明顯差異（圖2B）。在用600nm（OD600）0.002的光密度接種Pst DC3000，3天后在這些葉中檢測到疾病癥狀。 atbi1-2突變體表現出的癥狀較嚴重，因為幾乎所有的葉片都表現出嚴重的萎黃和壞死，而兩種轉基因品系表現出比atbi1-2和Col-0更輕微的疾病癥狀。轉基因植物的一小部分葉子是綠色的，沒有表現出萎黃和壞死。 Col-0葉中疾病癥狀的程度介于atbi1-2和兩個轉基因品系之間（圖2C）。在接種Pst DC3000或10mM MgCl 2（模擬物）后24小時監測SA水平。在模擬組中，在35S :: TaBI-1.1＃1中觀察到最高的SA水平，且顯著高于Col-0。在Pst DC3000處理下，與Col-0相比，在兩個轉基因品系中檢測到顯著較高的SA水平，并且在四種基因型中35S :: TaBI-1.1＃1含有最高的SA水平。 Col-0和atbi1-2之間的差異也達到了顯著水平（圖2D）。在0和3dpi時測量 atbi1-2，Col-0和兩個轉基因品系的葉片中的細菌滴度。在初始接種量（0dpi）中，在四種基因型中沒有觀察到致病細菌生長的顯著差異。在3dpi時，兩種轉基因品系的細菌滴度明顯低于Col-0，Col-0的細菌滴度也明顯低于atbi1-2，表明兩種轉基因品系對致病細菌的生長有較強的抑制作用，并且atbi1-2比Col-0更容易感染病原菌（圖2E）。基于兩個轉基因株系中較高水平的35S :: TaBI-1.1＃1，使用35S :: TaBI-1.1＃1來進一步檢測PR1的表達。高SA水平誘導PR基因的表達以增強植物對病原體攻擊的抗性。 PR1表達的增加或許可以解釋對Pst感染抵抗力的增強（圖2F）。
圖2. TaBI-1.1轉基因擬南芥對Pst DC3000的抗性增強
3.TaBI-1.1正向調節的SA相關基因表達
PR基因表達與SA積累和系統獲得性抗性（SAR）有關。進一步檢測了常規條件下生長2周齡Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1＃1幼苗中SA相關基因的表達。與Col-0和atbi1-2相比，在35S :: TaBI-1.1中觀察到PR1，PR5，ICS1和EDS1有顯著高表達水平。 然而，在這些基因表達水平中Col-0和atbi1-2之間沒有檢測到顯著差異（圖3）。 與Col-0相比，35S :: TaBI-1.1中PR1和PR5的表達水平分別增加了約11倍和9倍。 PR2，ICS1和EDS1表達的倍數變化低于PR1和PR5表達的變化（圖3）。因此，TaBI-1.1上調PR1，PR2，PR5，ICS1和EDS1基因的表達，表明 TaBI-1.1在SA信號傳導中起正向調節作用。
圖3. 通過qRT-PCR檢測正常條件下生長的atbi1-2，Col-0和35S :: TaB1-1.1 2周齡幼苗中5個SA相關基因的表達水平。
4.TaBI-1.1降低了SA和ABA的敏感性
將Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1的4日齡幼苗置于含有不同濃度SA，NaCl和ABA的MS培養基中，以研究Col- 0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1轉基因擬南芥植株在苗期響應SA和其他脅迫處理的不同表型。 13天后監測到形態學變化。在沒有生長調節劑的MS培養基上（MS0），在任何兩種基因型的Col-0，atbi1-2和兩種35S :: TaBI-1.1轉基因品系之間沒有觀察到顯著差異的根長，側根或鮮重（圖4A，E-G）。在補充有30μMSA的MS培養基上，atbi1-2與Col-0在鮮重，根長和側根數量上顯示出較大的差異（圖4H-J）。 35S :: TaBI-1.1＃2的側根數也與Col-0的側根數顯著不同（圖4J）。在含有30μMSA的MS培養基上生長的植物中，Col-0的異常生長程度介于atbi1-2和35S :: TaBI-1.1之間（圖4H-J）。高濃度SA會增加H2O2的積累并導致氧化損傷。當置于含有50μMSA的MS培養基上時，幼苗顯示更明顯的生長畸形。這些結果顯示，在SA濃度較高的情況下，幼苗遭受更嚴重的SA脅迫。用高濃度SA處理的葉子比用MS0培養基處理的葉子綠色淺，黃色淡和葉子小（圖4B）。在含有50μMSA的MS培養基上生長的35S :: TaB1-1.1＃1的根長顯著長于Col-0（圖4K）。35S :: TaBI-1.1＃1的鮮重和側根數與Col-0相比顯著增加（圖4L，M）。因此，SA不僅影響葉子的大小和顏色，而且影響根長，鮮重和側根數。
此外，研究人員檢查了在含有NaCl和ABA的MS培養基上生長的幼苗的表型。 在含有100和120mM NaCl的MS培養基上生長的植物之間沒有觀察到顯著差異（圖4C，N-S）。在用20μMABA處理后，atbi1-2的畸形程度比 Col-0和35S :: TaBI-1.1更明顯（圖4D）。 根據統計學分析，atbi1-2與Col-0相比在根長，鮮重和側根數上顯示出顯著差異，表明atbi1-2對ABA更敏感（圖4T-V）。 然而， 30μMABA處理中未觀察到根長，鮮重或側根數的明顯差異（圖4W-Y）。 因此，TaBI-1.1轉基因擬南芥對高濃度SA表現出降低的敏感性，并且atbi1-2突變體對ABA表現出增加的敏感性。
圖4. 在含有SA，NaCl或ABA的MS培養基上生長的atbi1-2，Col-0和35S :: TaB-1.1幼苗根長，鮮重和側根數的統計分析。
研究者進一步研究了TaBI-1.1在發芽過程中對ABA的敏感性。 在不同濃度的ABA的培養基上每12小時記錄發芽種子的百分比。在MS0培養基中，Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1轉基因擬南芥植物顯示相似的發芽率（圖5A）。 含有0.5μMABA的培養基中，兩種轉基因株系萌發顯著快于Col-0和atbi1-2（圖5B）。 在含有1μMABA的培養基上觀察不到顯著差異（圖5C）。 在含有2μMABA的培養基上，Col-0和兩種轉基因品系也比atbi1-2稍快地萌發（圖5D）。 以上結果表明，TaBI-1.1轉基因擬南芥對ABA的敏感性較低。
圖5. TaBI-1.1轉基因擬南芥在萌發過程中對ABA的敏感性降低。
5.擬南芥RNA-Seq分析中TaBI-1.1的表達
研究人員對35S :: TaBI-1.1＃1和Col-0植物進行了RNA-seq分析，以更好地理解TaBI-1.1功能。鑒定出48個上調基因和58個下調基因并做了一個熱圖。使用GO分析將差異表達的基因功能分類。富集了30多個GO terms，如圖6所示。對于上調的基因，富集的GO terms主要集中在抗生物脅迫，細胞免疫應答和SA合成與代謝相關的生物過程上。前10個關鍵的Go terms分別是防御反應、對外部刺激的反應、對生物刺激的反應、對外部生物刺激的反應、多生物體過程、對另一個生物體的反應、對另一個生物體的防御反應、對壓力的反應、單一生物體代謝過程和對化學物質的反應（圖6A）。對于下調的基因，富集的GO terms集中在細胞組分上，并且前三項是細胞組分，膜和細胞周圍（圖6B）。選擇七個上調基因和三個下調基因進行qRT-PCR實驗，結果表明，qRT-PCR結果與RNA-seq分析一致。
圖6. 使用RNA-seq分析GO terms在35S :: TaBI-1.1和Col-0之間差異表達的基因的富集
KEGG富集分析差異表達基因被呈現為散點圖。 使用富集因子、q值和通路中富集的基因數量來測量富集程度。 富集因子越高表示富集程度越高。觀察到上調基因富集了20多個KEGG通路。上調基因的前20個富集通路中，其中光合作用是最明顯的富集途徑（圖7A）。 光合作用的富集因子達到0.09，而q值大約為0。相反，下調基因的KEGG富集通路并不明顯，只有6個富集因子較低的通路被鑒定出來（圖7B）。因此，TaBI-1.1參與對生物脅迫的應答并主要通過基因上調表達來執行其防御功能。
圖7. 35S :: TaBI-1.1和Col-0差異表達基因的KEGG富集分析
6.TaBI-1.1與TaPIP1相互作用并在ER膜上與TaPIP1共定位
將TaBI-1.1置于PGBKT7（BD）載體中，用作誘導蛋白在酵母雙雜交實驗中篩選小麥cDNA文庫，以進一步探索TaBI-1.1調節應激反應的細胞機制。 結果，鑒定出一個候選的相互作用物質，水通道蛋白TaPIP1。 使用酵母雙雜交和pull-down測定來確定TaBI-1.1和TaPIP1之間在體內和體外的相互作用。將融合TaBI-1.1（BD-TaBI-1.1）的BD載體和融合TaPIP1（AD-TaPIP1）的pGADT7（AD）載體轉化到酵母細胞中。只有用BD-TaBI-1.1和AD-TaPIP1轉化的酵母細胞能夠在缺乏Trp，Leu，His和Ade（SD / -Trp-Leu-Ade-His）的選擇性培養基上生長。轉換TaBI-1.1和TaPIP1的融合載體產生相同的結果，表明TaBI-1.1與TaPIP1在酵母細胞中有相互作用（圖8A）。使用pull-down分析進一步確認相互作用（圖8B）。將TaBI-1.1克隆到pCold TM TF表達載體中在大腸桿菌中產生重組蛋白TF-His-TaBI-1.1。通過將序列克隆到pGEX-4T-1載體中，在大腸桿菌中成功產生了重組GST（谷胱甘肽S-轉移酶）-TaPIP1蛋白。使用抗His抗體的Western印跡所示，體外pull-down測定顯示TF-His-TaBI-1.1與GST-TaPIP1有物理互作（physically interacted）（圖8B）
AtBI-1定位于ER膜上，研究者在小麥原生質體中檢測了TaBI-1.1-GFP和mRFP-HDEL的共定位以確定TaBI-1.1的亞細胞定位。GFP和mRFP熒光的重疊系數 是0.69，表明TaBI-1.1與ER膜上的HDEL共定位（圖8C）。 鑒于TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用，研究者還檢測到TaPIP1-GFP和mRFP-HDEL之間的共定位以及TaBI-1.1-GFP和TaPIP1-mRFP在小麥原生質體中的共定位（圖8C）。 結果顯示TaBI-1.1和TaPIP1共定位于ER膜。
通過qRT-PCR檢測響應多次處理的TaPIP1的表達水平。 SA，NaCl和ABA處理使TaPIP1表達上調，這意味著TaPIP1可能參與對生物和非生物脅迫的反應（圖8D）。
圖8. TaBI-1.1和TaPIP1的相互作用和亞細胞定位
7.TaPIP1增加了擬南芥對PstDC3000感染的抗性
為了進一步研究TaBI-1.1和TaPIP1之間相互作用的潛在功能，研究人員構建了一個在 CaMV 35S啟動子控制下表達TaPIP1的轉基因擬南芥。選擇了兩個獨立的轉基因品系： 35S :: TaPIP1-1和35S :: TaPIP1-2，且TaPIP1的表達水平較高，這通過qRT-PCR分析進行了驗證（圖9A）。鑒于SA處理下TaPIP1水平的上調，推測TaPIP1也可能參與對病原體感染的響應。為了驗證這個想法，研究者在Pst DC3000感染下檢測了TaPIP1轉基因擬南芥的葉表型。在模擬處理下，Col-0和兩個轉基因品系的葉片中沒有觀察到差異（圖9B）。在用Pst DC3000接種后，發現Col-0葉片上明顯的褪綠癥狀，相反，兩種轉基因植物的褪綠癥狀較輕（圖9C）。為了進一步證實TaPIP1轉基因擬南芥中的抗性增加，在0和3dpi測量葉片中的細菌滴度。如圖9D所示，在初始接種量中Col-0和兩個轉基因品系之間沒有顯著差異，但是在3dpi時兩個TaPIP1轉基因擬南芥中的Col-0的細菌滴度顯著低于Col-0，表明TaPIP1轉基因擬南芥中病原菌的生長受到很大抑制。因此，TaBI-1.1和TaPIP1在響應Pst DC3000感染時表現出類似的作用，并且研究者推測TaBI-1.1和TaPIP1之間的相互作用可能涉及防御反應。
圖9. TaPIP1轉基因擬南芥對Pst DC3000表現出增強的抗性
創新點：
BI-1是一種局限于內質網（ER）膜的細胞保護蛋白，在對生物和非生物脅迫的應答中發揮重要作用。迄今為止，雖然已經鑒定了幾種與BI-1相互作用的蛋白質。然而，關于BI-1在內質網應激中機制的認知非常有限，BI-1調節植物內質網應激反應的機制目前尚不清楚，該研究中，通過禾谷鐮刀菌（Fg）處理的小麥的RNA-seq數據分析確定了小麥BI-1基因TaBI-1.1，揭示了TaBI-1.1和TaPIP1在響應病原體感染的ER膜上的相互作用的可能作用。
參考文獻：
Lu P P, Yu T F, Zheng W J, et al. The Wheat Bax Inhibitor-1 Protein Interacts with an Aquaporin TaPIP1 and Enhances Disease Resistance in Arabidopsis[J]. Front Plant Sci, 2018, 9:20.