11月14 【成功案例】小黑楊WRKY70基因在鹽脅迫和葉枯病響應中的作用
Populus simonii × Populus nigra?WRKY70 is involved in salt stress?and leaf blight disease responses
小黑楊WRKY70基因在鹽脅迫和葉枯病響應中的作用
雜志：Tree Physiology
影響因子：3.653
PMID:?28369503
研究背景：
WRKY超家族是重要的植物轉錄因子(TF)家族成員，其DNA結合域有保守的N端WRKYGQK七肽。WRKY蛋白可特異性識別結合靶基因啟動子的順式元件(CE)，w-box(TTGACC/T)。過去20多年的研究表明WRKY是多種生物學過程（如種子休眠/萌發、衰老、發育和生物/非生物脅迫響應）信號網絡的關鍵節點。WRKY蛋白通常會激活或抑制植物的轉錄調控過程，一些WRKYs甚至同時具有激活和抑制作用。一種WRKY 轉錄子也可調節幾個不同生物學過程。
植物常受到各種生物/非生物脅迫。鹽和病原體脅迫是常見的環境刺激，鹽脅迫會影響離子滲透壓平衡，排毒及生長調節過程。菌類脅迫會使植株產生葉斑，腐爛和枯萎。植物進化出精細響應調節機制來適應這些脅迫，許多TFs是生物/非生物脅迫信號響應網絡中重要的調控點。WRKY蛋白作為一種重要的脅迫響應TFs，參與了廣泛的生物和非生物脅迫響應過程。
小黑楊在中國北方分布廣，這種雜交白楊生長迅速，能很好地適應高鹽，寒冷，干旱和貧瘠的環境，因此是一種研究木本植物脅迫響應機制的理想材料。我們既往轉錄組分析結果表明，在小黑楊受到鏈格孢侵染或在鹽堿、干旱和重金屬脅迫下PsnWRKY70基因的表達量發生顯著變化。我們推測PsnWRKY70基因可能在小黑楊生物/非生物脅迫響應調控網絡中發揮重要作用。既往在WRKY蛋白的生物功能方面的研究進展較多，但關于調控機制的闡述有限。因此進一步研究PsnWRKY70轉錄子在小黑楊脅迫響應調控網絡中的作用具有重要意義。
材料和方法
材料：小黑楊
培養條件：
鹽脅迫實驗：在25-32℃溫室，自然光照條件下，140mM的NaCl溶液處理
葉枯病脅迫實驗：條件為:白天/晚上氣溫，25℃/20℃;濕度,50-60%;光周期,16小時光/8小時黑暗;光合光子通量，150 μmol m-2?s-1。
處理組：
.鹽脅迫實驗組：2個月月齡的NT，OEX和REX植株每隔三天用140mM的NaCl溶液處理。
葉枯病脅迫實驗組：2個月月齡的NT，OEX和REX植株噴灑鏈格孢菌孢子懸液。在處理前(0 h)和處理后36 h收集第三至第五功能葉片用于提取RNA。分別在0天，處理后3、6、9、12天收集第六到第八個功能葉用于MDA含量測定。
對照組：用水處理，所有樣本三個重復。
轉錄組分析:在葉枯病抗性分析培養條件下培養的NT、OEX1和REX1的植株，長到30厘米后用140 mM的NaCl溶液處理。收集鹽脅迫36小時后的第五個功能葉(兩個重復)
測序平臺：百邁客高通量測序平臺Illumina HiSeq 4000
分析平臺：百邁客云平臺（BMKCloud）主流程和小工具
方法：
本文擬研究小黑楊的生物/非生物脅迫響應調節網絡。進行了下列實驗：
- 啟動子克隆及序列分析：為全面了解PsnWRKY70基因的生物學功能，對PsnWRKY70啟動子進行克隆，并對啟動子CEs進行了生信分析，預測了PsnWRKY70的轉錄起始位點（TSS）并進行PCR驗證。
2.酵母單雜交篩選和驗證：進行了酵母單雜交篩選來研究PsnWRKY70基因的上游調控子，并對PsnWRKY70，PsnMYB，PsnNAM和PsnGT1蛋白質與PsnWRKY70基因啟動子互作關系進行分析。
3.PsnWRKY70基因序列和表達分析：對PsnWRKY70基因開放閱讀框和保守域進行預測，確定了PsnWRKY70 TF的物理化學參數，預測了亞細胞定位。并與TAIR和RGAP數據庫部分擬南芥和粳稻的Group III WRKY TFs序列進行多重序列比對(ClustalW）構建得到不同物種32種WRKY蛋白的系統進化樹（MEGAver.6.0）。
4.基因克隆、遺傳轉化和驗證：克隆了PsnWRKY70的開放閱讀框架(ORF)并融合到綠色熒光蛋白(GFP)中，OEX和REX載體通過農桿菌介導的葉片轉換法將重組子轉移到小黑楊中。并進行了PCR、Northern blot、表達量水平的驗證。
5.脅迫分析：根據表型、損傷指數、丙二醛(MDA)含量和基因表達模式對轉基因和非轉基因(NT)組的鹽脅迫耐力和葉枯萎病抗性進行評價和比較。
6.轉錄組分析：為進一步確定了PsnWRKY70 轉錄子的鹽脅迫反應調節機制，選擇鹽脅迫處理的轉基因和NT葉片作為樣本進行轉錄組測序和分析。
研究結果：
1.啟動子分析和酵母單雜交實驗
克隆了2471bp的PsnWRKY70基因的啟動子序列，分析顯示提示許多脅迫響應CEs存在于PsnWRKY70的啟動子區域，這些CEs中,W-box(TGAC)和GT1元素(GAAAAA)是高度富集的，酵母單雜交篩選結果顯示，有五個基因(PsnBTB/POZ、PsnCCD1、PsnZFP、PsnWRKY70、PsnFP)可與W-box及其相鄰序列結合，同時七個基因產物(PsnNAM、PsnDDS1、PsnMYB、PsnLHTP、PsnGT1、PsnETIF6-2、PsnAPD）可與GT1元件和其鄰近序列結合。
為進一步證實PsnWRKY70 /PsnMYB / PsnNAM /PsnGT1蛋白與相應CEs的互作關系，將報道載體(pCAM-Wr/Wm/Gr/Gm) 和效應載體(pROKII-W70/MYB/GT1/NAM)共轉移到煙草葉片中，GUS/LUC相對活性實驗表明：在鹽脅迫條件下PsnWRKY70可特異性結合W-box,而PsnMYB、PsnGT1、PsnNAM可特異性結合GT1元素。
2.PsnWRKY70基因序列分析和表達分析
PsnWRKY70的ORF長度為966bp,編碼321個氨基酸的蛋白質。單WRKY域和Cx7Cx23HxC-type鋅指狀模體表明PsnWRKY70 TF是Group?III成員。PsnWRKY70蛋白化學式可能的是C1553H2405N445O513S16,理論pI 為5.72，分子量為36.03 kDa。亞細胞定位顯示PsnWRKY70存在于細胞核的可能性最大。多序列比對結果顯示PsnWRKY70與擬南芥和粳稻的Group?III WRKY TFs一致(圖1)。系統發育分析結果表明PsnWRKY70和胡楊WRKY70具有高同源性(XP_011001689.1)(圖2)。qRT-PCR 檢測PsnWRKY70在小黑楊不同組織種表達水平不同，在葉中高表達,根和莖中低表達，因此選擇葉片作為材料進行后續實驗。
圖1多重序列比對（紅盒框內序列為保守WRKY域,藍框內氨基酸殘基為鋅指模體。）
圖2系統發育分析：來自不同物種的WRKY蛋白質系統發育樹,紅色標識的蛋白質為PsnWRKY70 TF
3.PsnWRKY70 轉基因植株的培育和驗證
為進一步研究PsnWRKY70 基因在不同脅迫中的生物學功能，通過轉基因實驗，構建小黑楊PsnWRKY70基因過表達和抑制表達的轉基因植株，并在轉基因和NT植株中進行了脅迫響應分析。得到了8個OEX植株和10個REX植株并通過gDNA?PCR、Northern blot、基因表達水平結果進行了驗證。
4.轉基因植株和NT植株的鹽脅迫和葉枯病脅迫響應
數據顯示在正常生長條件下REX植株(REX1-REX3)一般都比OEX(OEX1-OEX3)和NT植株高(表1和2)。
在鹽脅迫下,REX植株的RHGRs明顯大于NT和OEX。此外,在所有鹽脅迫處理的植株中,REX1有最大的RHGR(0.296±0.008),而OEX2是最小的RHGR(0.199±0.011)(表1)。在病菌脅迫下，REX往往比NT和OEX生長慢。OEX3的RHGR最大(0.264±0.019)REX1的RHGR最小(0.154±0.012)。(表2)。
表1鹽脅迫下的OEX、REX和NT植株的HG
表2葉枯病脅迫下OEX、REX和NT植株的HG
葉鹽損傷指數表明,OEX比NT和REX損傷更大。而葉病指數表明,REX比NT和OEX葉疾病癥狀更嚴重。此外,REX2葉鹽害指數最小(52.06%±1.34%),OEX2葉枯病指數最小(27.30%±1.50%)(圖3a-d）。
圖3 ?OEX、REX和NT植株的表型觀察、葉鹽損傷指數/疾病指數和MDA含量分析。(a，b)在高鹽和病原體的脅迫下表型觀察結果;NT-L、OEX2-L和REX1-L表示NT、OEX2和REX1的第9-12個功能葉。(c,d)
OEX、REX和NT的葉鹽損傷指數和葉病指數。不同列字母標記的表示不同的line間有顯著差異(e，f)OEX、REX和NT在鹽和病原體脅迫下MDA含量。
脂質過氧化作用終產物MDA是一個重要細胞膜損傷的生化標記。一般來說,在鹽和病菌脅迫時OEX、REX、NT植株中MDA含量大大增加(圖3e和f)。三天鹽脅迫處理后,OEX的MDA水平顯著高于NT和REX(圖3e)。真菌感染三天后,NT和REX的MDA含量高于OEX(圖3f)。值得注意的是,在鹽脅迫時OEX2有最大的MDA增幅，而在病菌脅迫時MDA增幅的最小。(圖3e和f)
為研究在鹽和病菌脅迫下PsnWRKY70的表達模式，進一步驗證酵母單雜交分析的結果，對PsnWRKY70，PsnNAM，PsnMYB，PsnGT1基因進行了qRT-PCR 驗證。結果顯示,在NT中，鹽脅迫處理36小時后:PsnWRKY70和PsnNAM輕度下調(FC < 2)，而PsnMYB和PsnGT1持平;在OEX2中PsnWRKY70,PsnMYB，PsnGT1明顯下調(FC≥2);在REX2中PsnMYB(2.03倍)和PsnGT1(1.32倍)上調，PsnWRKY70和PsnNAM持平。在葉枯病響應中:NT和REX1的四種基因都表達明顯上調，在OEX2中，PsnNAM和PsnMYB幾乎不變,PsnWRKY70和PsnGT1顯著下調。聚類分析表明NT植株在鹽脅迫和病菌脅迫下PsnWRKY70、PsnNAM， PsnMYB， PsnGT1表達模式相似(圖4)。
圖4 鹽脅迫、病菌脅迫下NT和轉基因line的表達變化趨勢的聚類分析
5.NT、OEX1，REX1的轉錄組分析
測序矯正后得到141.4MB的clean reads，每個文庫20-30MB,Q30≥94.45%，約12.5-18.1MB數據可比對到毛果黃肉楠楊樹基因組，與NT相比，OEX1中有517個DEGs（338個上調，179個下調），鹽脅迫下REX1中有70個DEGs（27個上調，43個下調）(圖5)
在所有DEGs中有許多上調或下調的MAPK級聯成員，GO分析結果顯示與莽草酸酯生物合成，分支酸合成，細胞程序性死亡負調控，真菌抗性，水楊酸合成相關的GO terms在OEX1中顯著富集，而在REX1顯著富集的是與抗旱響應，尿素跨膜運輸、脫落酸響應，鈣離子運輸和過氧化氫跨膜運輸相關的GO terms。KEGG富集揭示與苯丙氨酸代謝，過氧化物酶體，植物病菌互作，以及芳香族氨基酸的生物合成，次級代謝，苯丙烷類和氨基酸的相關的DEGs在OEX1中顯著富集，在REX1中富集到與嘧啶、醚脂代謝途徑以及泛醌，類萜醌，芳氨酸、角質、軟木脂、蠟生物合成相關的DEGs。OEX1中富集到的生物過程中，竟有一些疾病抗性相關的通路。這些通路主要與以下DEGs相關：Potri.013G153400,Potri.009G082900、Potri.004G089400 Potri.017G126200,Potri.002G216800和Potri.003G150200
圖5 NT/REX1和NT/OEX1間的DEGs的維恩圖。紅色綠色分別是上調和下調的基因
研究結論：
此研究中，我們鑒定并克隆了PsnWRKY70基因和啟動子，用酵母單雜交分析來檢測上游調控子，脅迫響應分析顯示OEXs比NT有更強的葉枯病抗性，REXs比NT有更強的鹽耐力，NTvsOEX1的DEGs與NTvsREX1的DEGs展現了巨大的差異，基于NT和OEX1的DEGs預測PsnWRKY70 TF的潛在靶基因。總結如圖6，PsnWRKY70 TF的脅迫響應信號機制未完全闡明，有待進一步研究。
圖6 對PsnWRKY70 TF的高鹽脅迫/葉枯病脅迫響應信號轉導途徑的圖解（上游調節因子(PsnBTB/POZ, PsnCCD1, PsnZFP, PsnWRKY70, PsnFP, PsnNAM, PsnDDS1, PsnMYB, PsnLHTP, PsnGT1, PsnETIF6-2 and PsnAPD) 通過特異性結合w-box或GT1元件調控PsnWRKY70基因的表達，在植物細胞環境下，進行了 PsnWRKY70, PsnNAM, PsnMYB and PsnGT1蛋白(紅色標記的)與w-box和GT1元件結合的活性和特異性的驗證。HP1、RRM Ulp1和一些MAPK級聯成員與PsnWRKY70 TF相互作用，參與到鹽脅迫響應網絡中;預測的PsnWRKY70 TF的靶基因列于虛線框中）
創新點
本研究構建了REX,OEX重組子導入小黑楊中。根據表型、損傷指數、丙二醛(MDA)含量和基因表達模式對轉基因和非轉基因(NT)組的鹽脅迫耐力和葉枯萎病抗性進行評價和比較，并進行了生物學功能及信號傳導通路相關探討。不僅揭示了PsnWRKY70基因的鹽脅迫響應信號轉導途徑，也證實小黑楊的PsnWRKY70轉錄因子在鹽脅迫和葉枯病的反應響應中的生物功能，有助于我們了解小黑楊的生物/非生物脅迫響應調節網絡并進行后續深入研究。